固相微萃取—气质联用色谱法的分析应用

　　固相微萃取技术是在固相萃取的基础上，结合顶空分析建立起来的一种新样品预处理方文章来源华夏酒报法。目前，SPME结合GC—MS已被广泛运用于酒类风味物质的分析中。

　　此次研究对象是产自黑龙江的一种新型的发酵酒，其主要以高粱、小米、玉米、糯米等为原料，采用完全发酵工艺酿造。该酒基除了易挥发的醇、醛、酸、酯类物质之外，还含有大量的糖、蛋白质等大分子物质。

　　研究采用顶空固相微萃取结合气相色谱—质谱联用方法对其中的风味物质进行测定，以消除基质的干扰。利用建立的HS—SPME 结合GC—MS 方法对四种样品进行分析测定，共定性出33 种香气组分，并定量出其中26种。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　由黑龙江省某公司提供的新型发酵酒共4种成品酒。HP—5890 气相色谱仪；QP2010 型气相色谱—质谱联用仪；固相微萃取装置。定量用26 种香味组分标准品；内标化合物叔戊醇、乙酸正戊酯、2—乙基正丁酸；所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 顶空—固相微萃取方法。取1mL样品于15mL顶空瓶中，用蒸馏水稀释10倍，用3g无机盐饱和，旋紧瓶盖涡旋3分钟，于50℃水浴下保温45分钟，进样气相色谱，解析7分钟。

　　1.2.2 仪器方法

　　气相色谱条件：毛细管色谱柱为CP—Wax 57CB（50m×0.25mm×0.2μm），起始柱温40℃，保持1分钟，以4℃/分钟 的速率升温至70℃，保持1分钟，然后以8℃/分钟 的速率升至100℃后再以15℃/分钟 升至200℃，保持25分钟。进样口温度230℃，检测器温度240℃。

　　质谱条件：EI 电离源，离子源温度230℃，全扫描模式，质量扫描范围：50amu—500amu，对采集到的质谱结果利用NIST 谱库进行检索定性。

　　1.2.3 定量分析方法

　　利用内标法对样品中26 种香味物质进行定量。考虑到萃取头对不同类物质的吸附效率有所不同，实验选择了三种内标（叔戊醇、乙酸正戊酯和2—乙基正丁酸）对不同类的化合物分别进行定量，以提高测定结果的准确性。

　　2 结果与讨论

　　2.1 SPME 萃取效果的单因素实验

　　固相微萃取吸附效率的影响因素主要包括萃取头涂层、萃取时间、萃取温度、加盐量和解析时间等。选择样品酒中具有代表性的香气成分异丁醇、正戊醇、正己醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸、丁酸和己酸共9种芳香物质，通过优化SPME 萃取条件，确定最佳的提取方法，对其主要香气成分进行吸附萃取实验。

　　2.2 萃取头的选择

　　整个固相微萃取装置中，最关键的是萃取头的选择。首先，应对所萃取的物质有较强的吸附，即“亲和系数”最大；其次，萃取头的热稳定性要好，因为吸附的待测物质是通过色谱仪的气化室高温解析出来的。

　　目前，酒类分析中使用较多的涂层是非极性的聚二甲基硅氧烷和极性的聚丙烯酸酯。研究选用85μmPA和100μmPDMS 两种萃取头作比较实验。

　　2.3 萃取时间的选择

　　选用85μm PA 萃取头，在0.30g/mL 加盐量，吸附温度50℃的条件下，选取15分钟、30分钟、45分钟 和60分钟 四个时间点对萃取时间进行优化。

　　随着萃取时间的延长，各组分含量不断上升，但是当萃取时间超过45分钟后，异丁醇、正戊醇、正己醇的萃取量呈下降趋势。这是因为随着时间的延长，吸附在萃取头上的易挥发物质得到解析的缘故。同样，乙酸和丁酸在30分钟 吸附量达到最高值后呈下降趋势。当挥发性成分接近亚平衡状态时，如果样品在相同的条件下进行萃取，也可以对被分析物进行较准确地测定。

　　综合三类组分的萃取效率变化情况，认为该样品吸附时间为45分钟 能够达到最佳的萃取效果。

　　2.4 萃取温度的选择

　　升高温度有利于香气物质在酒中的扩散并缩短平衡时间，但同时也会使萃取头对香气成分的吸附量减少，影响SPME 的灵敏度。选用85μmPA 萃取头，在0.30g/mL 加盐量，吸附时间45分钟的条件下，选择五个梯度的水浴温度对样品的萃取温度进行优化。升高温度可以增强香气成分的萃取效果，但是当温度超过50℃时对正己醇、己酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯5 种香气物质的萃取效率呈下降趋势；丁酸是在40℃条件下达到最大萃取效果后再呈下降趋势；异丁醇和正戊醇的萃取效率一直随着温度的提高呈上升趋势，60℃时吸附效果最好。温度太高可能会使酒中香气物质发生化学变化，将50℃作为萃取的最佳温度。

　　2.5 无机盐浓度的选择

　　减少被分析物在水溶液的可溶性，能使更多的挥发性物质挥发至溶液的顶空，吸附到纤维头，从而降低该方法的检测限，提高香气物质的响应值。在溶液中加入强电解质无机盐NaCl，溶液的粒子强度增加，使有机分析物的非极性相对增强并使其在水溶液中的溶解度下降，萃取量得到增加。但同时NaCl的加入会影响基质粘度，降低分析物的扩散速度，产生盐的负效应，所以需要对NaCl 加入量进行优化。在85μmPA 萃取头，吸附温度50℃，吸附时间45分钟的条件下，向每10mL 样品溶液中分别加入0g、1g、2g、3g、4g的固体NaCl，充分搅拌后按以上条件进行吸附处理并进样。不加入NaCl 时丁酸达到吸附最大效果，加入1g（0.10g/mL）时丁酸乙酯的吸附量达到最大，加入量是3g（0.30g/mL）时乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸、己酸和异丁醇5 种香气成分达到最高值，加入量为4g （0.40g/mL）时只有正己醇的吸附效率最高，其它香气物质呈下降趋势。实验结果说明不同物质的挥发性对NaCl 的用量存在着差异，所以最后确定的NaCl 加入量为3g（0.30g/mL）。

　　2.6 解析时间的选择

　　在50℃水浴、萃取时间为45分钟、加盐量为3g的条件下研究解析效率与解析时间的关系，选取的时间点为3分钟、5分钟、7分钟和9分钟。

　　可见，改变解析时间对乙酸乙酯、异丁醇和正戊醇的萃取效率影响不大；丁酸乙酯、己酸乙酯、正己醇、以及丁酸在7分钟 时解析相对完全；延长时间至9分钟，乙酸和己酸的萃取效率略有增加。考虑到解析时间过长会影响萃取头的寿命，故选择7分钟 为最佳解析时间。本实验定性出的33 种香气成分中，酯类物质14 种，占香气种类总数的42.4%；酸类物质9 种，占香气种类总数的27.3%；醇类物质7种，占香气种类总数的21.2%；醛类物质1种，占香气种类总数的3.0%；其他2种。

　　3 结论
　　

　　主要研究结果如下：

　　3.1 通过条件优化，确定了HS—SPME 的最适条件为：在15mL 装有磁力搅拌器的顶空瓶中加入1.0mL 样品以及9.0mL 蒸馏水，萃取头类型选择85μmPA，添加无机盐3g，于50℃水浴下保温45分钟，进样气相色谱，解析7分钟。

    　3.2 利用建立的HS—SPME 结合GC—MS 方法对四种样品进行研究测定，共定性出33 种香气组分，包括酯类物质14种、酸类物质9 种、醇类物质7 种、醛类物质1 种、其他物质2种，并定量出其中的26 种组分。