复合酯化酶对固态发酵白酒微量成分的影响

　　白酒生产中酯化酶是指脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶的统称，其主要作用是催化有机酸与乙醇经生物化学作用生成相应的乙酯。复合酯化酶是生物酶和活菌体的生态混合体，其在白酒酿造中的主要作用有：强化有机酸酯化酶活性，可将酒醅中大部分有机酸迅速酯化为相应的乙酯；含有耐酸性产己酸的梭状芽孢杆菌，可利用酒醅中乙酸和乙醇合成己酸；具有大量糖化微生物，耐酸性强，水解淀粉速率平稳，活力持久，酒醅残糖低；发酵能力强；含有高产酸性蛋白酶的微生物，增强了大曲蛋白酶活力，使原料中的蛋白水解彻底，丰富了发酵微生物的营养，增加了白酒香味成分的前体物质，使酒体丰满，酒味协调。笔者以大曲配合复合酯化酶作为糖化发酵剂，通过单因素实验，系统地分析研究复合酯化酶对固态白酒发酵中酸、酯、醛、醇等微量成分产生的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　复合酯化酶：济南久益生物工程有限责任公司；大曲：四特酒有限责任公司；小型甑桶：四特酒有限责任公司；气相色谱仪：Agilent HP—6820，安捷伦科技有限公司；液相色谱仪：Agilent 1200HLC，安捷伦科技有限公司；陶坛（25 L）：市场上购买。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验方法

　　在凉床上取摊晾后准备下曲的原料糟醅100kg，均匀地分成5份，每份准备曲粉1.5kg。将称好的复合酯化酶同备好的曲粉一起与酒醅混合均匀，最终使酒糟中复合酯化酶的用量分别达到投粮量的0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，装坛、密封置于保温室内开始发酵。27天后从陶坛中取出酒醅样品，用30L小甑桶分别对发酵酒醅进行蒸馏，蒸馏酒基送色谱室进行色谱分析。

　　1. 2.2 酒样乳酸的测定

　　采用美国Agilent 1200HLC 型液相色谱仪测定。

　　1. 2 .2 .1 样品液的制备

　　白酒样品经0.45μm有机滤膜过滤后，直接进样。

　　1. 2 .2 .2 液相色谱分析条件

　　色谱柱：ZORBOX SB—C18 4.6×250mm；流动相：甲醇：磷酸二氢钾为4：60。分析参数：检测波长210nm，流速0.8mL/min，柱温40℃，进样量为5 μL。

　　1 .2 .3 酒样微量成分的测定0020

　　采用美国Agilent HP—6820 型气相色谱仪测定。

　　1.2 .3 .1 样品液的制备

　　准确移取10mL酒样于10mL容量瓶中，加入2%的三内标（叔戊醇、醋酸正戊酯、二乙基正丁酸）混合液0.1mL，摇匀。

　　1 .2 .3 .2 进样

　　用10 μL微量进样器吸取已配制好的样品液，进样1μL。

　　1 .2 .3 .3 色谱分析条件

　　色谱柱：CP—Wax 石英毛细管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm），分析参数：进样口温度230℃，检测器温度250℃，柱温40℃平衡1min后，按照4℃/min 升温至80℃，再按8℃/min升温至100℃，继而15℃/min升温到200℃后保持24min。

 

　　 

 

　　

 

　　

 

图1  酯化酶对酯类物质生成的影响

　　

 

　　2 结果与分析

　　将色谱分析结果换算为标准酒度60%vol时各微量成分的含量。考察复合酯化酶对基酒微量成分的影响。

　　2 .1 复合酯化酶对基酒中醛类物质生成的影响

　　分析酒体中的醛类物质，结果见表1。

　　从表1中可以看出，基酒中醛类物质的生成随复合酯化酶的变化表现出有增有减，并没有明显的规律性，白酒发酵中醛类的合成途径主要有醇的氧化、酮酸脱羧、氨基酸脱氨、脱羧等，与复合酯化酶并没有直接性的联系。

　　2 .2 复合酯化酶对基酒中酸类物质生成的影响

　　对基础酒中的酸类物质进行分析，其结果见表2。

　　从表2中可以看出，复合酯化酶的加入能逐步提高基酒中的总酸、乙酸、己酸的量，与没有添加复合酯化酶的对照组相比，当复合酯化酶的添加量为2 .5%时，总酸提高了38 .6%，乙酸提高了17 .9 %，己酸提高的最为明显，达到62 .8 %；乳酸、丙酸则呈现出逐步降低的趋势，当复合酯化酶的添加量为2 .5%时，乳酸降低了25 .9%，丙酸降低了17 .4%。

　　复合酯化酶中含有较多的己酸菌、米曲霉、根霉，这些微生物的存在极大地丰富了糟醅中的有机酸及己酸，同时由于己酸菌能够利用乳酸合成己酸，因此使糟醅中的乳酸浓度大幅下降，己酸浓度大幅上升。由于乳酸的量被己酸菌大量利用，由此丙酸菌能利用的乳酸相对减少，产丙酸的量也逐步减少。复合酯化酶的添加对异丁酸的产量几乎没有影响。

　　2 .3 复合酯化酶对基酒中杂醇类物质生成的影响

　　在白酒发酵过程中，杂醇类物质的生成途径主要有两个：一是酵母以糖为基质的合成代谢路径，常发生在发酵材料中氨基酸氮过低时，酵母不得不通过糖代谢，走酮酸路线去合成必需的氨基酸，进而合成自身细胞蛋白，其中间体酮酸在酶的作用下脱羧、还原可以生成杂醇；二是酵母以氨基酸为基质的降解代谢路径，常发生在发酵物料中氨基氮充足时，过多的氨基酸在酵母酶系的作用下，脱氨基、脱羧基生成比氨基酸少一个碳原子的杂醇。表3为复合酯化酶用量对杂醇油的影响结果。

　　从表3可以看到，在复合酯化酶的添加量小于1%时，异戊醇、正丙醇、异丁醇的量有缓慢的下降，在添加量为投粮的1%—2%时，上述三者下降迅速，异戊醇从0.462g/L 下降到0.287g/L，正丙醇从0.199 g/L下降到0.165g/L，异戊醇则从0.462g/L 下降到0.287g/L， 此后再增加酯化酶的用量，杂醇类物质产量只有少量的减少，当添加量为2 .5%时，相对于没有添加复合酯化酶的对照组相比，异戊醇、正丙醇、异丁醇的量分别减少了48 .6%、22 .4% 和49 .8%，总体下降明显。复合酯化酶中含有高产酸性蛋白酶的微生物，增强了酒醅中的蛋白酶活性，使糟醅中的氨基酸氮的量有所增加，从而避免了酮酸在酶的作用下脱羧、还原可以生成杂醇。继续增加则会产生过多的氨基酸，其在酵母酶系的作用下，脱氨基、脱羧基生成比氨基酸少一个碳原子的杂醇，从而使杂醇油的减少变缓。

　　2 .4 复合酯化酶对基酒中酯类物质生成的影响

　　白酒在酿造发酵过程中，有机酸与乙醇经生物化学作用而生成的乙酯，谓之乙酯化。 从微生物而论， 酵母菌、 霉菌和细菌都有酯化能力， 综观人们对四大乙酯的认识、 实验与应用主要在霉菌与酵母菌上。运用复合酯化酶来提高基酒中的各种酯类的含量在白酒生产的应用越来越受到重视。图1为酯化酶对酯类物质生成的影响。

　　从图1可以看出，复合酯化酶在固态白酒发酵工艺下，对乙酸乙酯的影响不明显，乙酸乙酯主要是产酯酵母在生长初期在有微量氧的情况下形成的，与糟醅中乙酸菌、乙酸的量并没有很大的关系，因此复合酯化酶的加入虽然能够提高糟醅中乙酸的含量，但对于乙酸乙酯的形成并不会产生影响；复合酯化酶的加入对乳酸乙酯的影响呈现出波动性变化，变化幅度不显著；丁酸乙酯的量随着复合酯化酶用量的增加呈现出先上升后下降的趋势，当复合酯化酶的添加量为1%时，丁酸乙酯的量达到0.018g/L，比对照提高了8.44%，此后随复合酯化酶的增加而逐渐降低；丙酸乙酯随复合酯化酶的增加而不断降低，当复合酯化酶的添加量为2%时，相比于对照组降低了47.3%；己酸乙酯随复合酯化酶的添加而增加显著，当复合酯化酶的添加量为2.5%时，表明复合酯化酶在固态白酒发酵过程能发挥很好的产己酯能力。产酸微生物的存在是生成酯类物质的基础，复合酯化酶在强化了有机酸酯化酶活性的基础上，提高了糟醅中产酸微生物的量，这对于提高糟醅中酯类含量具有明显效果。

　　3 讨论

　　白酒中酯类的生成途径主要有两条：一是通过有机化学反应生成酯，常温下进行缓慢，往往需要经过几年时间才能使酯化反应达到平衡；二是由微生物的生化反应生成酯，这是白酒生产中产酯的主要途径。

　　从研究结果中可以看出，复合酯化酶的添加不但能够一定程度上降低基酒中大部分杂醇类物质的含量，还能丰富基酒中酯类物质的含量，尤其是己酸乙酯含量提高显著，比未添加复合酯化酶的对照提高了26.9倍，达到了0.858g/L，这与复合酯化酶中含有的大量己酸菌与产酯微生物分不开。