浓香型白酒窖池微生物可培养细菌系统发育分析

    　浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，发酵过程栖息在窖池糟醅、窖泥中的庞大微生物群落在糟醅固、液、气三相界面进行着复杂的物质能量代谢过程。

　　发酵过程中产生的黄水充当着窖泥与糟醅物质交换的载体，封窖发酵形成的窖内压力变化使酒糟中的养分和来自曲药、环境中的微生物及代谢产物，不断通过黄水进入泥中，而窖泥中长期驯化的微生物种群及其代谢产物又不断地进入糟醅中，物质能量交换不断地影响着窖泥生态环境，促进了窖泥老熟和酒质的提高。
　　然而，特定的地理、气候等环境条件造就了特定的微生物生长环境。所以，不同的酒厂生产的白酒呈现出不同的风味和品质。

    　因此，分析白酒窖池中微生物的群落结构和亲缘关系，对于研究中国白酒风味因子形成机理、有效地控制生产环境条件和名优白酒生产的品质，有着积极的意义。

    　大分子rRNA及其基因rDNA已被作为一个分子指标，广泛地应用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。把待测菌株的16SrDNA序列测定出来，然后与数据库中的已知菌种进行比较，即可确定供试菌株的分类地位。这种方法不仅最大程度地保证结果的准确性和客观性，而且对于微生物资源和环境的研究也有重要的价值。

    　因此，本试验通过对分离到的细菌进行16SrDNA的序列分析，探讨贵州地区浓香型白酒窖泥和酒醅中微生物的组成和系统发育情况。在本研究中，贵州地区浓香型白酒窖池中的微生物和四川境内酒厂中的微生物类群相似，但也有区别。

1 材料与方法

    　1.1主要试剂、仪器及培养基

    　PCR仪为L文章来源华夏酒报angGene MG96G；菌株DNA提取、16SrDNA片段扩增和纯化所用的各种酶、Marker、dNTPs、Buffer等试剂为上海生物工程有限公司产品；企业试剂均为国产分析纯。

    　牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水100ml，pH7.2—7.4，121℃灭菌20min。需要注意的是，液体牛肉膏蛋白胨培养基不加琼脂。

    　1.2样品的采集和菌株的分离

    　1.2.1样品来源
    　样品来自贵州某名酒厂盛夏生产用新窖窖池中的酒醅，发酵周期为60天，发酵正常。
　　新窖窖龄为2年，取样时每个样品分单粮上层、中层，多粮上层、中层不同部位采集；另外，还采集了窖泥壁、窖底泥和窖皮泥，所有样品采集后抽真空冷冻保藏。

    　1.2.2菌株的分离
    　分别取样，加入约1倍的灭过菌的PBS缓冲液，用涡旋振荡器振荡5min，于3000r/min离心5min，去上清液于10000r/min离心2min，弃上清液，沉淀重复洗涤2次，收集菌体备用。

　　用无菌生理盐水对收集的菌体做10倍梯度的逐级稀释，在牛肉膏蛋白胨平板上涂布分离，挑取形态有差异的单菌落，初步识别后，转种于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基，编号保存，进行菌株的表型形状观察和实验。

    　1.3菌株的初步鉴定和归类

    　按照《伯杰氏细菌坚定手册》（第八版）和《微生物学实验手册》等的鉴定方法，对所分离到的菌株进行形态学特征的观察和生理学特征的测试。并根据所观测到的结果对所有菌株进行归类，将形态特征和生理学特征高度一致的归为同一类群。

    　1.4基因组DNA的提取

    　参照《精编分子生物学实验指南》的方法，略作修改。取1.5ml的培养菌液4000r/min离心2min；沉淀物加入565uL的DE缓冲液重悬，加入30uL10%的SDS、10uL20mg/ml的蛋白酶K和10uL10mg/ml的溶菌酶中国酒业风向标华夏酒报邮发代号23-189当地邮局可订阅，混匀，于37℃温浴1h；再加入NaCl和CTAB/NaCl混合液，65℃温浴10min；然后用phenol:chloroform:Isoamyl Alcohol（25:24:1）混合液和chloroform:Isoamyl Alcohol（24：1）混合液分别进行抽提。

    　上清液加入异丙醇，混匀后于—20℃的温度下对其沉淀30min，12000r/min离心弃上清液，最后用无水乙醇洗涤1遍，弃乙醇。向DNA沉淀中加入30uLTE缓冲液，37℃温浴30min。

　　所得DNA溶解于TE缓冲液中，置于—20℃中保存。

    　1.5 16SrDNA和PCR扩增及测序

    　以细菌基因组DNA为模版，采用细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩增。

　　PCR反应的条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸100s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
　　经PCR反应扩增出16SrDNA，用PCR及酶反应产物纯化试剂盒将PCR产物来进行纯化后，再送交上海工程服务技术公司检测。

 

2结果与分析

   　2.1菌株的生态特征和生理学特征

    从以上酒醅样品中分离出203株细菌，窖泥样品中分离出274株细菌，（其中窖泥壁87株、窖底泥92株和窖皮泥95株），初步鉴定这447株细菌中绝大多数是芽孢杆菌属细菌（446株）。

    　2.2 16SrDNA的PCR纯化结果

    　对分离菌株进行16SrDNA的PCR纯化，已分离的芽孢杆菌属代表菌株的16SrDNA的分子大小基本上都在1400bp—1500bp之间。

    　2.3 16SrDNA序列同源性分析

    　从20个类群中各取一株代表菌株，将其16SrDNA序列在NCBI中用BLAST进行同源性分析，结果又发现高度一致性的菌株。各类群代表菌株16SrDNA的同源性分析结果见表1。

    　由表1可看出，所有代表菌株的16SrDNA序列通过Blast检索，都能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株的相应序列。

　　所分析的多粮窖池样品中细菌绝大多数为芽孢杆菌，并以芽孢杆菌属的菌株为主，占总芽孢杆菌菌数的98.43%。

    　除芽孢杆菌属菌株之外，还分离出极少量的Brevibacillus的不确定种菌株，占已分离总芽孢杆菌菌数的1.57%。

3讨论

    　在GenBank中用BLAST进行比较分析发现，从多粮窖池中分离到的芽孢杆菌与常规已知菌种都有很高的同源性。其中，将99%—100%全序列相似的判定为一个种，将97%—99%全序列相似性的判定为一个属。根据上述标准，多粮窖池中分离到的这些芽孢杆菌大都能直接鉴定到种，只有一类菌同源性为98%，只能鉴定到属。

    　由于微生态环境的差异和微生物长期的驯化作用使得贵州地区浓香型白酒窖池中可培养的细菌以芽孢杆菌属为主。

    　从本实验可以看出，如果仅仅运用传统的微生物菌落形态和生理生化鉴定，并不能得到非常准确的结果。运用分子生物学的方法鉴定菌株能在一定程度上弥补了传统微生物鉴定的缺陷，使相关菌株分类鉴定更加科学和符合实际。

    　在细菌类鉴定中，用16SrDNA序列分析方法鉴定菌株也一般只能鉴定到属或种的层面上，还需要生物技术分析方法。

    　由于窖池中生态环境复杂多变，以及微生物之间的共栖关系，窖池中还有一部分包括芽孢杆菌在内的微生物无法分离培养。因此，仅仅分析可培养的微生物不能完全反映出窖池中的情况，对不可培养的芽孢杆菌的分析还需进一步探讨。另外，随着发酵时间的推移、生态环境的改变，微生物种群结构也会相应地发生变化，因此，还需要对发酵过程进行动态跟踪。